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细胞中与硒汞拮抗作用相关的金属蛋白的研究

自1960s亚硒酸钠(Se(Ⅳ))和氯化汞(Hg(Ⅱ))间的拮抗作用被发现以来,Se(Ⅳ)便作为一种潜在的汞毒性解毒剂受到了研究者们的广泛关注。大量实验证实Se(Ⅳ)能够降低Hg(Ⅱ)的毒理效应并且显著影响汞在机体内的含量、分布和形态转变等。硒汞拮抗作用的研究对象非常广泛,包括动植物个体、细菌、细胞、硒/汞污染地区人群等,目前已经发展到分子水平上的研究。但是,相比于动植物个体方面的数据积累,细胞中硒汞拮抗作用的报道则非常少,而且硒和汞在生命体内的形态转变、完整代谢途径和相互作用机制等都还需要更深入的探究。为了实现分子水平上的机理研究,同时考虑到生物样品的多样性和复杂性,特别是细胞样品的珍贵和量的局限,需要借助于多种高效和高灵敏度的分析技术。金属组学是一门系统研究生命体(尤其是细胞)中所有金属元素的分布、形态、含量和功能等的学科。随着金属组学的发展,机体内金属组的分析方法也在不断完善,包括金属蛋白的提取和分离方法、金属组的定量分析方法、金属组的空间分布研究方法以及金属-生物分子配合物的形态和结构分析方法等。不同方法间的多维联用有利于深入探究金属元素参与机体新陈代谢和生命活动的过程和机制。借助于金属组学的分析策略,可以对硒和汞的含量、形态、分布和代谢活动等信息进行多方位的探究,从分子水平上阐释机体内硒汞拮抗作用机制。本论文的目的是基于金属组学中的多种联用技术,对HepG2细胞中与硒汞拮抗作用相关的金属蛋白进行鉴定分析,在分子水平上探究硒汞在HepG2细胞中的代谢途径和拮抗机制。本论文的研究内容包括:(1)利用尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-ICP-MS)联用技术,初步考察了 Hg(Ⅱ)单独暴露和不同比例Hg(Ⅱ)/Se(Ⅳ)共暴露的HepG2细胞内含Se、Hg的生物分子形态的分子量分布和相对含量变化。首先,通过MTT实验得出Hg(Ⅱ)和Se(Ⅳ)对HepG2细胞的半致死量分别为50 μM和120 μM。当Hg(Ⅱ)的暴露剂量25 μM或者Se(Ⅳ)的暴露剂量≤0 μM时,细胞都能维持至少80%的存活率。实验选择Hg(Ⅱ)的暴露浓度为5 μM,Hg(Ⅱ):Se(Ⅳ)暴露比例依次为1:1、1:3和1:6。当Hg(Ⅱ)单独暴露于细胞时,Hg(Ⅱ)代谢为大分子形态(67 kDa)和小分子形态(1 kDa～7 kDa)两组形态;随着Se(Ⅳ)的加入和不断增加,Hg小分子形态逐渐减少,直至Hg(Ⅱ):Se(Ⅳ)=1:3时不再检出;而Hg大分子形态逐渐增多,与其保留时间一致的Se大分子形态也同样大幅增多。Se/Hg大分子形态和Hg小分子形态的变化具有很大的相关性。由此推测,Se、Hg相关的大分子组形态为硒蛋白/硒蛋白复合体与Hg的结合产物或者类似核壳结构的(HgSe)n-Proteins配合物。(2)针对第一阶段表征出的小分子区段形态(1 kDa～7kDa),利用毛细管反相色谱-电感耦合等离子体质谱(capRPLC-ICP-MS)、毛细管反相色谱-电喷雾电离质谱(capRPLC-ESI-MS)和毛细管反相色谱-电喷雾电离串联质谱(capRPLC-ESI-MS/MS)三种色谱-质谱联用技术对Hg(Ⅱ)单独暴露时该区段中的Hg-MT进行了鉴定,并分析了其金属结合情况。首先,通过capRPLC-ICP-MS和capRPLC-ESI-MS在该小分子区段检测出四种不同分子量的 Hg-MT,它们的质荷比 m/z 依次为:1691.1056(z=5)、1637.0824(z=5)、1710.6929(z=5)和 1730.2909(z=5)。然后,通过 shotgun 法,即capRPLC-ESI-MS/MS联用技术、Mascot软件检索和UniProt蛋白信息库,确证以上四种蛋白为MT的不同亚型和次亚型。综合以上信息,得出Hg(Ⅱ)暴露条件下MT的金属结合情况为:m/z 1637.0824(z=5)对应的metal-MT为Hg9Zn2-MT-1G 或者 Hg9Cu3Zn-MT-1M,m/z 1691.1056(z=5)对应的metal-MT 为 Hg11-MT-1G,m/z 1710.6929(z=5)对应的 metal-MT 为Hg11Zn3-MT-2,m/z 1730.2909(z=5)对应的 metal-MT 为 Hg12Zn-MT-1G isoform 1或者Hg11Zn3-MT-1G。换言之,HepG2细胞内MT在Hg(Ⅱ)的暴露下会结合9-12个Hg,在分子水平上探究了 Hg(Ⅱ)在HepG2细胞中的重要代谢途径。(3)针对第一阶段表征出的大分子区段形态(67 kDa),利用SDS-PAGE-LA-ICP-MS联用技术平行对比分析了汞单独暴露、硒汞共暴露(Hg(Ⅱ):Se(Ⅳ)=1:3)下的HepG2细胞中大分子形态(Hg-1和1:3-1),确定凝胶中的含Se、Hg条带。含Hg条带停留在分离胶顶端,目标含汞形态未得到分离。后续可继续借助X射线吸收近边结构谱和扩展X射线吸收精细结构谱对其进行表征,理论上可以得出Se和Hg的键合形式以及配位结构,据此判定1:3-1中的硒汞拮抗产物是否为推测的(HgSe)n-Proteins结构。